Post by jone447 on Aug 2, 2023 6:55:11 GMT
μL Protein G 磁珠缀合的抗 myc 抗体在 4 °C 下免疫沉淀过夜。使用与每 mL350 μL Protein G 磁珠缀合的抗 Tial1 抗体在 4 °C 下免疫沉淀内源 Tial1 过夜。将珠子在 IP 洗涤缓冲液（50 mM HEPES-K，pH 7.5，200 mM KCl，0.05% (v/v) NP40）中洗涤 3 次，并重悬于一珠体积的 IP 洗涤
缓冲液中，并用终浓度 0.13 U/μl 的 RNase亚洲手机号码列表 T1 处理，并在 37°C 下孵育 5 分钟。将珠子在冰冷的高盐缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，500 mM KCl，0.05% (v/v) NP40）中洗涤 3 次，并重悬于一珠子体积的去磷酸化缓冲液中（50 mM Tris-HCl，pH 7.9，100 mM NaCl，10 mM MgCl）2、1mM DTT)。添加小牛肠磷酸酶至终浓度 0.
5 U/μl，在 37 °C 下孵育 30 分钟，并在磷酸酶洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，20 mM EGTA，0.5%（v/v）中洗涤两次） ) NP40)。交联的 RNA 用 γ- 32标记将原始珠体积中的 P-ATP 终浓度调整为 0.5 μCi/μl，将 T4 PNK 终浓度调整至 1 U/μl，37 °C 孵育 30 分钟。添加非放射性 ATP 以获得 100 μM 的终浓度，并在 37 °C 下再孵